河北医科大学研究生导师：宋淑霞

　　河北医科大学导师介绍：宋淑霞

　　◇ 科研(或学术)情况简述：

　　主要从事肿瘤微环境及肿瘤疫苗研究。 肿瘤的免疫治疗作为一种重要的治疗手段，近些年虽然在动物实验上取得了重大进展，但临床治疗结果还不尽人意。随着对肿瘤生物学及肿瘤免疫学研究的不断深入，人们认识到肿瘤已不再简单地等同于基因表达异常的癌细胞，还应包括与肿瘤细胞发生相互作用的成纤维细胞、免疫细胞、上皮细胞及特定的间质细胞等，这些不同类型的细胞受到恶性肿瘤的募集，形成一个适合肿瘤细胞生长而使免疫细胞活性受到抑制的微环境。肿瘤微环境不仅为肿瘤细胞增殖、恶性演变提供了“肥沃土壤”，也是钝化免疫治疗武器，使瘤细胞逃避免疫监视的重要因素。因此，人们对肿瘤的研究不能再只局限在肿瘤细胞本身，而对肿瘤细胞所处的微环境也应该加以重视。目前，肿瘤微环境作为保护和支持肿瘤发生发展及转移复发的必要机构功能单元的理论已为越来越多的学者所接受，而肿瘤微环境也成为肿瘤治疗的靶子。研究肿瘤免疫微环境的形成机制及其干预策略是肿瘤学的重要研究领域。由于构成微环境的因素众多且不同因素间存在网络调节的复杂性，目前仍缺乏较好的策略来实现肿瘤微环境的逆转，这也影响了肿瘤免疫治疗的疗效。鉴于炎症是肿瘤免疫微环境的重要特征及NF-κB、STAT3-IL-6信号在致炎中的重要作用，提出利用miRNA多靶点整体性调节分子，通过对致炎信号分子的调节，有可能作为一种新的治疗策略来实现对肿瘤免疫微环境的精细调节。我们选用miR-155/miR-21这一组免疫相关microRNA作为肿瘤免疫微环境的调节因素进行研究，重点探索miRNA对肿瘤相关免疫抑制分子的影响(包括对MDSCs、TAM、T-Reg等肿瘤组织抑制性细胞的募集及与之相关的免疫抑制分子表达的调节)及其对肿瘤疫苗的增效作用和机制，从而提出新的针对肿瘤免疫微环境的治疗策略，促进肿瘤免疫治疗领域的发展。另外，肿瘤细胞与其周围的基质细胞相互作用对抑制性肿瘤微环境的形成及肿瘤的恶性进展具有重要作用。肿瘤微环境由肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经、血管和多种炎性/免疫细胞组成。其中，成纤维细胞和肌成纤维细胞是除了肿瘤细胞外，细胞数最多的基质细胞。肿瘤相关成纤维细胞(CAF)是指从肿瘤患者的肿瘤组织中分离到的一种活化的成纤维细胞，表达α-SMA和FAP是其特征之一，是肿瘤生长和进展的重要因素。一般来说，肿瘤的形成要依赖于肿瘤细胞对基质细胞而且主要是肌成纤维细胞的募集和利用，主要是对其提供促肿瘤形成的信号并使之演变为CAF。随着肿瘤与CAFs的不断接触和刺激，一方面，CAFs活性增强并可通过旁分泌和自分泌方式产生大量的细胞因子，包括趋化因子SDF-1(CXCL12)和CXCL14、细胞因子IL-6、TGF-β，调节自身和周围其它细胞的生长、血管形成，甚至诱导肿瘤细胞发生EMT转化;另一方面，肿瘤细胞改变其周围基质细胞的特征形成以利于肿瘤细胞生长的微环境的能力更加突出。因此，肿瘤细胞与CAFs的直接和间接接触对肿瘤微环境的形成和调节非常重要。二者通过对话相互调节各自的基因表达谱，最终使肿瘤微环境成为肿瘤细胞生长的肥沃“土壤”。因此，研究二者的相互作用机制，对于阻断二者相互促增殖的正反馈调节的环节，改善肿瘤微环境的免疫细胞的活性，提高肿瘤治疗效果意义重大。因此，我们的工作主要集中在三部分：第一部分：(一)建立MiR-155/miR-21高表达或高效效抑制性细胞株采用本室保存的4T07、4T1及其他商品化乳腺癌细胞株进行实验。分别采用MiR-155/miR-21、的过表达质粒和抑制剂表达质粒，稳定转染乳腺癌细胞株。将选取的靶microRNA委托公司进行合成，获得其minics模拟物或抑制剂分子。将筛选的候选microRNA及其抑制物用脂质体转染相应的乳腺癌细胞株，从而实现体外的microRNA过表达或敲除细胞模型。(二)用MiR-155/miR-21高效抑制性细胞株和MiR-155/miR-21高表达对肿瘤微环境相关基因表达进行筛选与验证主要包括：(1)可溶性分子检测：ELISA法。利用ELISA方法分析正常培养的细胞上清中IL-6、TGF-β、TNF-α、CCL21、CCL22、CXCL12的表达;(2)细胞膜分子检测：Weasternblot方法。利用Weasternblot方法分析趋化因子受体CXCR4，促进肿瘤细胞增殖的VEGFA、NK-ΚB及STAT3基因的表达。最终筛选出一组与MiR-155/miR-21相关的蛋白分子，为下一步实验提供基础信息。(三)用MiR-155/miR-21高效抑制性细胞株和MiR-155/miR-21高表达分析对LPS等炎性介质刺激的反应体外培养MiR-155/miR-21高效抑制性细胞株和MiR-155/miR-21高表达细胞株，分别给予不同浓度的LPS并刺激不同时间，然后利用qRT-PCR或Westernblot方法分别分析不同细胞株的IL-8、TNF-α、TGF–β及IL-6的表达。MiR-155/miR-21过表达和敲低的乳腺癌细胞株接种小鼠后，采用LPS刺激，检测瘤体内IL-8，IL-6，IL-1β的表达情况。(四)确定特定MiR-155/miR-21高抑制细胞株肿瘤组织中抑制性细胞浸润首先建立小鼠荷瘤模型，体内给予或不给于miR-155/miR-21表达抑制剂，分离肿瘤组织中的白细胞，流式细胞术分析BMDC、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、T-Reg、Th17细胞浸润情况。主要采用免疫组化和流式细胞术分析miR-155/miR-21、过表达和敲低的乳腺癌细胞株接种小鼠后形成的肿瘤微环境中，MDSC(髓系来源的抑制细胞Gr-1+CD11b+)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、T-Reg(CD4+Foxp3+)、Th17(CD4+IL-17+)细胞数浸润及肿瘤组织中CTL活性的变化。(五)探索高效抑制特定MiR-155/miR-21与DC疫苗治疗的协同作用(1)DC疫苗制备及活性检测：首先体外培养小鼠骨髓细胞，Fit3L诱导DC分化。(2)用凋亡细胞浆蛋白负载DC细胞。先将肿瘤细胞经γ射线照射至凋亡，然后采用低渗的方法提取凋亡细胞总蛋白，但去掉凋亡细胞的细胞膜，我们用westernblot方法观察到经γ射线处理的凋亡细胞的细胞膜成分(包括凋亡小体)含有大量TGF-β，凋亡细胞浆TGF-β很低，HMGB1及hsp70蛋白成分相对较高。(3)采用先用TNF-α+IL-6+IL-1β+PGE2联合刺激36h，再经poly(I:C)刺激24h的两步法诱导DC成熟。(4)采用体外诱导T细胞增殖和对大颗粒蛋白“吞噬”活性进行DC的活力判定(见CancerLett，2007，256：90-100)。(2)协同疗效观察：建立小鼠荷瘤模型，体内给予或不给于miR-155/miR-21表达抑制剂，然后皮下注射DC疫苗，观察二者联合作用后对肿瘤微环境的改善效果，肿瘤特异性免疫水平，肿瘤生长情况及小鼠荷瘤生存时间。 第二部分：(一)CAF分离培养及炎性相关基因表达分析 1.从小鼠移植性乳腺癌组织(4T1或67NR)中分离CAFs，正常成纤维细胞从小鼠皮肤或肺组织中获得。分别分析两种成纤维细胞α-SMA、FAP及波样蛋白的表达，比较两种成纤维细胞的区别。然后对两种细胞参与肿瘤炎性微环境相关基因的表达进行分析。因为与肿瘤微环境相关的基因甚多，主要集中在：STAT3-IL-6、CXCL12、CXCL14、CXCR4、TGF-β/SMAD2、VEGF、TNF-α，以初步了解CAFs在肿瘤炎性微环境中的作用。 2.4T1与67NR分别为高转移和低转移肿瘤细胞株，用该两种细胞株分别制备移植肿瘤，分别分析CAFs在上述基因表达方面的差异。因为生物学行为不同的肿瘤细胞形成的肿瘤微环境中的CAFs，其活性可能存在差异。了解这种差异对深入理解肿瘤微环境的形成非常重要。(二)CAF诱导上皮来源肿瘤细胞EMT转化 1.将CAF或正常成纤维细胞与67NR细胞共(接触)培养或用Transwell小室培养系统(非直接接触)培养，观察67NR肿瘤细胞的形态及E-Cadherin、N-Cadherin、ZEB1和ZEB2、Snail2、vimentin及Twist分子表达，目的：观察CAFs对肿瘤细胞EMT的影响。另外，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞与作为基质的CAFs的接触应该有直接或间接。间接接触可能会通过细胞因子，目前已知CAFs表达SDF-1(CXCL12)，其配体是肿瘤细胞的CXCR4;CAFs还表达高水平的肝细胞生长因子(HGF)，其配体是表皮细胞癌表达的c-Met。因此，在确认CAFs对上皮型肿瘤细胞有EMT的作用后，可通过分析SDF1/CXCR4及HGF/c-Met，甚至stat3/IL-6不同信号通路，来研究CAFs诱导肿瘤细胞发生EMT转化的分子机制。 2.给体外培养的CAF转染PAI-1的小干扰RNA，24h后，再与67NR细胞共(接触)培养或用Transwell小室(非直接接触)培养，观察肿瘤细胞形态及E-Cadherin、N-Cadherin、ZEB1和ZEB2、Snail2、vimentin、Twist等分子表达。我们以前的实验证实，用沉默PAI-1的小分子RNA(siRNA)转染体外培养的经TGF-β诱导的成纤维细胞后，可下调其α-MSA和IL-6的表达。同时，该沉默PAI-1的siRNA还可以在体内使经博莱霉素处理的大鼠肺组织的α-MSA和IL-6表达下调。因此，我们认为PAI-1基因沉默后可能会降低CAF的活性，进而可能会干扰对EMT的形成。(三)肿瘤细胞对肿瘤相关成纤维细胞(CAF)的活化作用 1.将4T1肿瘤细胞与乳腺癌组织中的CAFs或正常组织的成纤维细胞共(接触)培养，或用Transwell小室(非直接接触)培养，分析CAFs或成纤维细胞的α-MSA、SDF-1(CXCL12)、TGF-β/TRβII、VEGF、IL-16基因表达。了解肿瘤细胞对CAFs活性的调节作用。肿瘤微环境中肿瘤细胞及其周围的成纤维细胞是主要的细胞组成成分，二者的直接和间接接触对肿瘤微环境的调节非常重要。二者通过对话相互调节各自的基因表达谱，最终使肿瘤微环境成为肿瘤细胞生长的肥沃“土壤”。因此，研究二者的相互作用机制，对于改善肿瘤微环境的免疫细胞的活性，提高肿瘤治疗效果意义重大。 2.下调stst3-IL-6炎性轴的表达后对肿瘤基质成纤维细胞的作用用miR-21或miR-155的抑制剂处理4T1细胞，使miR-21或miR-155表达下调，可显著降低stst3-IL-6的表达及活性。然后同上法观察CAFs的α-MSA、SDF-1(CXCL12)、TGF-β/TRβII、VEGF、IL-6基因表达。目的：经miRNA抑制剂的处理，使肿瘤细胞炎性基因表达谱发生变化，改变肿瘤细胞与CAFs之间相互作用的结果，即改变二者相互促增殖的正反馈作用。本课题组前期工作显示，4T1肿瘤细胞高表达miR-21和miR-155，同时高表达多种炎性细胞因子及参与炎性因子表达的转录因子，如stat3/IL-6、NF-κB、TNF-α、IL-8。用miR-21或miR-155的抑制剂处理4T1细胞使miR-21或miR-155表达下调后，stat3/IL-6、NF-κB、TNF-α的表达也下调。改变肿瘤细胞的行为后，对与之相接触的CAFs甚至免疫细胞作用也会有所改变。(四)CAFs对DCs活性的影响 1.将CAF或正常成纤维细胞与体外诱导的DCs细胞共(接触)培养或用Transwell小室培养系统(非直接接触)培养，观察DCs的细胞MHCII、CD83、CD40等分子的表达;同时观察DCs对异基因个体的naiveT细胞刺激作用。目的：观察CAFs对DCs活性的影响。预实验观察到CAFs的stat3/IL-6基因表达较正常的成纤维细胞活跃，因此，CAFs对DCs的活性和功能可能有一定影响。 2.给体外培养的CAF转染PAI-1的小干扰RNA，24h后，再与DCs细胞共(接触)培养或用Transwell小室(非直接接触)培养，观察DCs的活性和功能。通过沉默PAI-1抑制其活性，进而实现解除对DCs的抑制作用。肿瘤细胞通过分泌IL-10或TGF-β可抑制DC细胞的活性，但CAF是否对DC细胞也有类似的抑制作用还不清楚。(五)序贯下调miR-21/miR-155和沉默PAI-1对DC疫苗的增效作用我们前期动物实验研究结果表明，单独DC疫苗可在一定时间内很好地抑制肿瘤细胞生长(肿瘤移植后20~30天内，治疗10~15天内)，但随荷瘤时间延长，肿瘤会突然加速生长。原因之一是发现肿瘤组织中有大量BMDC、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、T-Reg细胞的浸润。通过下调肿瘤细胞的miR-21/miR-155和沉默CAFs的PAI-1，一方面改善肿瘤细胞炎性因子或致炎基因表达，另一方面抑制肿瘤基质CAFs的活性，进而使抑制性的肿瘤微环境得到改善，最终结果可能会对免疫细胞包括肿瘤特异性CTL的抑制性训化作用减弱。研究microRNA抑制剂和使CAFs失活的小RNA(siRNA)瘤内注射给药对DC疫苗的疗效改善，有希望开发新型的DC疫苗佐剂，无疑对于DC疫苗的发展和临床应用具有很大意义。在小鼠接种miR-155/miR-21及高表达的乳腺癌细胞株模型中，采用胆固醇修饰的microRNALNA抑制剂进行瘤内治疗，下调miR-155/miR-21或/和的表达;然后序贯给予化学修饰的沉默PAI-1的siRNA和DC疫苗治疗，检测疫苗免疫学指标、肿瘤生长情况和小鼠生存期，肿瘤微环境中TAM、MDSC及T-Reg细胞的浸润情况。研究其对DC疫苗疗效的影响。 第三部分：肿瘤术后转移及复发是影响肿瘤患者预后的难题。常规化/放疗等策略均在毒性与疗效的均衡方面存在缺陷并限制了最终疗效。采用多种治疗策略小剂量联合，使术后患者建立主动免疫，对预防转移和复发可能有重要意义。本研究依据细胞坏死的“危险信号”学说，提出采用小剂量比柔吡星或紫杉醇联合DC疫苗治疗的策略，并提出以下机制假说：小剂量化疗杀伤后HMGB1等危险信号释放促进DC疫苗TLR活化;活化DC疫苗诱导宿主自身DC广泛活化;活化宿主DC启动宿主的全面抗肿瘤免疫，包括Treg抑制，NK、T细胞激活等。本研究拟利用转移性乳腺癌4T1与DC疫苗在体外和荷瘤小鼠模型上进行相关研究，并通过TLR4-/-和CD11c-DTR/GFP(可致DC缺陷)小鼠模型，研究上述联合方案中的TLR相关机制及宿主自身DC活化机制。最终探讨DC疫苗联合化疗后对患者建立自身抗肿瘤免疫功能的影响，为骨肉瘤临床治疗寻找更安全有效的新型策略。(一)比柔吡星或紫杉醇处理的肿瘤细胞裂解物在体外活化DC (1)体外培养的小鼠乳腺瘤细胞4T1，用适量浓度的比柔吡星或紫杉醇处理。(2)ELISA和Westernblot方法分别测定培养上清及细胞中的HSP70和HMGB1的含量。(3)从小鼠骨髓中诱导DC细胞分化，用比柔吡星或紫杉醇处理的肿瘤细胞负载DC，流式细胞仪测定DC的CD40、MHCI、ICAM-1及CD86表达。(4)ELISA法测定DC培养上清的IL-12p70、TNF-α、IFN-α、IL-10。(二)小剂量比柔吡星或紫杉醇联合DC疫苗对肿瘤细胞生长抑制作用(1)DC疫苗制备：用上述经比柔吡星或紫杉醇处理的细胞裂解物与DC共培养后，用0.1μg/mlLPS和5μg/ml抗CD40抗体诱导DC成熟。(2)抑瘤实验：给BALB/c荷瘤小鼠经尾静脉注射一定量的比柔吡星或紫杉醇，5d后瘤内注射DC疫苗。观察肿瘤生长并绘制肿瘤生长曲线。(三)DC疫苗增强比柔吡星或紫杉醇治疗乳腺癌疗效的作用机制(1)TLR4的作用：将用比柔吡星或紫杉醇处理的4T1肿瘤细胞免疫TLR4-/-小鼠，经DC疫苗加强或不经DC细胞加强，分析脾脏和引流淋巴结T细胞活化情况，从而分析比柔吡星或紫杉醇是否通过TLR4激活免疫系统。(2)DC疫苗联合比柔吡星或紫杉醇治疗后对宿主DC及NK细胞活性的影响：本研究中使用DC疫苗的目的，一是激活宿主的T细胞发挥抗肿瘤作用，二是提高宿主自身DC及NK细胞的活性。一旦宿主自身DC被动员，该DC将被比柔吡星或紫杉醇杀死的肿瘤细胞裂解物中“危险信号”诱导成熟并激活;而激活的NK细胞则直接杀伤肿瘤细胞。(3)比柔吡星或紫杉醇对肿瘤细胞对CTL的敏感性的影响：将DC疫苗免疫的小鼠脾脏淋巴细胞经体外灭活的4T1细胞和IL-2刺激7d，诱导CTL形成;用低剂量比柔吡星或紫杉醇处理的4T1做靶细胞，体外观察CTL对靶细胞的杀伤作用。(4)比柔吡星或紫杉醇对Reg-T细胞的影响：观察脾脏、引流淋巴结及肿瘤组织中CD4+CD25+T细胞(Reg-T)分布及肿瘤组织趋化因子CCL22的表达。CCL22是趋化Reg-T细胞向肿瘤组织浸润的关键细胞因子，Reg-T细胞可抑制CD8+T细胞分化及CTL活性，因此，肿瘤组织中Reg-T细胞数减少，与肿瘤细胞生长抑制及CTL活性提高有密切关系。

　　◇ 发表学术论文情况：

　　年度刊物名称题目卷期署名

　　2009 vaccine Vaccination with Combination of Fit3L and RANTES in a DNA Prime-protein Boost Regimens Elicits Strong Cell-Mediated Immunity and Antitumour Effect 27(1) 第一作者

　　2011 现代免疫学杂志 肿瘤相关成纤维细胞影响肿瘤微环境的研究进展 31(6):473-476 通讯作者

　　2008 细胞与分子免疫学杂志 病毒样颗粒疫苗研究进展 24(11) 通讯作者

　　2011 European Journal of Cancer Tumour-derived IL-10 within tumour microenvironment represses the antitumour immunity of Socs1-silenced and sustained antigen expressing DCs proof 第一作者

　　2008 细胞与分子免疫学杂志 HLA-A*0201/Kb 及MAGE-3基因共转染B16细胞的制备及其在MAGE-3 肿瘤疫苗评价中的作用 24(7) 第一作者

　　2008 现代免疫学杂志 Flt3L与CCL5细胞因子佐剂对DNA疫苗抗原特异性免疫应答的促进作用 28(5) 通讯作者

　　2007 vaccine Evaluation of antitumor immunity efficacy of epitope-based vaccine with B16 cell line co-expressing HLA-A2/H-2kb and HCC-derived CTL multiepitope in HLA transgenic mice 25(10) 第一作者

　　2007 Cancer Lett Augmented induction of CD8+ cytotoxic T-cell response and antitumor effect by DCs paulsed with Virus-Like Particles loading with CpG 256(5) 第一作者

　　2007 Cellular Immunology Generation of chimeric HBc proteins with epitopes in E.coli:Formation of virus-like particles and a potent inducer of en-specific cytotoxic immune response and anti-tumor effect in vivo 247(6) 通讯作者

　　2011 中国免疫学杂志 STAT3信号促进肿瘤免疫抑制微环境形成的研究进展 27(12):121-125 通讯作者

　　2010 Clin & Exp Immunol Significant anti-tumour activity of adoptively transferred T cells elicited by intratumoral dendritic cell vaccine injection through enhancing the ratio of CD8+T cell/regulatory T cells in tumou 2010. 162: 75–83 第一作者

　　2010 Chemotherpy Molecular Mechanism of Cell Apoptosis by Paclitaxel and Pirarubicin in a Human Osteosarcoma Cell Line 2010;56(2):101-7 第一作者

　　2010 中国免疫学杂志 顺铂联合DC疫苗对小鼠抗肿瘤作用观察 26(10)：890-894 第一作者

　　2010 细胞与分子免疫学杂志 Hsp70L1增强肿瘤免疫疫苗免疫原性的研究 26(4)：340-343 通讯作者

　　2010 中国免疫学杂志 对携带HCC表位的HBc病毒样颗粒负载的DC疫苗的免疫评价 26(8)：679-683 通讯作者

　　◇ 出版著作情况：

　　名称出版单位类别作者年度

　　◇ 成果获奖情况：

　　成果名称颁奖单位等级获奖年度排名

　　RANTES与Flt3L基因克隆及其对抗原特异性免疫应答的促进作用 河北省医学会 一等奖 2009 1

　　犬传染性肝炎核酸疫苗研究 河北省医学会 一等奖 2010 2

　　包裹CpG的HBc-VLP负载的DCs诱导长效CTL活性及抗肿瘤作用研究 项目验收 其它 2011 1

　　SOCS1基因沉默联合TLR4,TLR9受体刺激促进DC疫苗的抗肿瘤作用研究 项目验收 其它 2011 1

　　◇ 完成主要科研项目：

　　项目名称任务来源完成形式鉴定验收单位主要结论排名

　　RANTES与Flt3L基因克隆及其对特异性免疫应答的促进作用 部,省项目 课题鉴定 河北省卫生厅 国际先进 1

　　犬传染性肝炎核酸疫苗联合CpG佐剂免疫效果及其免疫机制 部,省项目 课题鉴定 河北省卫生厅 国际先进 2

　　包裹CpG的HBc-VLP负载的DCs诱导长效CTL活性及抗肿瘤作用研究 部,省项目 项目验收 省科技厅 优秀 1

　　HSP70L1-TRP2融合基因克隆及其免疫增强作用研究 部,省项目 项目鉴定 省科技厅 国内先进 2

　　SOCS1基因沉默联合TLR4,TLR9受体刺激促进DC疫苗的抗肿瘤作用研究 部,省项目 项目验收 省科技厅 通过 1

　　提高肿瘤疫苗免疫效果的新型免疫佐剂的研制 部,省项目 项目验收 省教育厅 通过 1

　　◇ 目前承担的主要项目(在研)：

　　项目名称项目类别起讫时间经费(万元)本人承担任务

　　miR-155/miR-21联合抑制对肿瘤免疫微环境的逆转作用及其机制研究 国家自然基金 2011.1-2013.12 30.00 课题设计

　　◇ 主讲课程：

　　课程名称学时授课对象教材

　　医学免疫学 170 本科生+本硕生 人卫出版社第5套

　　分子生物学 80 研究生 人民军医出版社

　　◇ 招生要求：

　　招生年度拟招生名额对考生要求

　　2012 0 本科毕业热爱科研工作